一、癥狀
HSV感染是一種全身性疾病，病毒經(jīng)呼吸道、口腔、生殖器粘膜或破損皮膚進(jìn)入人體，可潛于人體正常粘膜、血液、唾液以及局部感覺神經(jīng)節(jié)和多數(shù)器官內(nèi)，幾乎所有的內(nèi)臟和粘膜表皮內(nèi)都可分離到HSV。
原發(fā)感染多為隱性，大多無臨床癥狀或呈亞臨床表現(xiàn)，僅有少數(shù)(約1-10%)可以出現(xiàn)臨床癥狀。主要見于免疫功能低下嬰幼兒或嚴(yán)重營養(yǎng)不良或有其它感染的兒童，成人罕見。原發(fā)感染消退后，病毒可持續(xù)潛居體內(nèi)。正常人中約有半數(shù)以上為本病毒的攜帶者，可通過口、鼻分泌物而成為傳染源，由于HSV在人體中不產(chǎn)生永久免疫力，故每當(dāng)機體抗病能力減退時，如患某種發(fā)熱性傳染病，胃腸功能紊亂、月經(jīng)、妊娠、病灶感染、過度疲勞、情緒環(huán)境改變時，體內(nèi)潛伏的HSV即被激發(fā)而發(fā)病。
HSV-1主要引起口唇皰疹，咽炎，角膜結(jié)膜炎和散發(fā)性腦炎，而HSV-2感染主要引起生殖器皰疹，但在臨床上也有相反情況。
HSV感染的潛伏期為1-45天，平均為6天，HSV-1感染主要發(fā)生于口角、唇緣、鼻孔等皮膚粘膜交界處，亦可見顏面或口唇，開始局部先有灼癢及輕度緊張感，偶有伴發(fā)神經(jīng)痛。隨即出現(xiàn)紅斑，在紅斑基礎(chǔ)上發(fā)生簇集性小丘疹，迅速變?yōu)樗诹Ｖ辆G豆大小的水皰，內(nèi)容澄清，水皰破裂后出現(xiàn)糜爛面，數(shù)日后干燥結(jié)痂。自覺灼癢，偶有倦怠，不適和輕微發(fā)熱等全身癥狀，愈合可遺留暫時性色素沉著。全病程1-2周左右。
HSV-2感染主要發(fā)生于生殖器部位，患部先有燒灼感，很快在紅斑的基礎(chǔ)上發(fā)生成群的小水皰，多見男性包皮、龜頭、冠狀溝、陰莖等處，偶見于尿道;女性常見于陰唇、陰蒂、陰道、宮頸等處。水皰可逐漸變成膿皰，約6天左右破潰而形成糜爛或淺的潰瘍，自覺疼痛。病人可發(fā)生尿道炎，出現(xiàn)排尿困難。多數(shù)人有腹股溝淋巴結(jié)腫大疼痛，有的病人可出現(xiàn)發(fā)熱、肌肉痛及腦膜炎癥狀。如發(fā)于女性宮頸者可形成潰瘍壞死，陰道分泌物增多，可有下腹痛。應(yīng)注意有無宮頸癌發(fā)生。孕期患生殖器皰疹時易致流產(chǎn)、早產(chǎn)或死胎，并易使新生兒感染，發(fā)生新生兒單純皰疹。本病一般經(jīng)過3周左右可以痊愈，但常有反復(fù)發(fā)作，一般原發(fā)疹后1-4個月內(nèi)復(fù)發(fā)，癥狀較原發(fā)者輕，范圍亦小，局限于生殖器部位，有時僅有1-2個皰疹，病程亦短，自發(fā)病至愈合8-12天。本病也可伴有生殖器以外部位的感染，如口唇、臂部及中樞神經(jīng)系統(tǒng)等。
二、體征
皮損為紅斑基礎(chǔ)上可見成群的水皰或膿皰或成糜爛及潰瘍。女性患者約90%伴有HSV宮頸炎，宮頸可見發(fā)紅、糜爛、潰瘍，有膿性陰道分泌物。有的患者可有腹股溝淋巴結(jié)腫大壓痛或體溫升高。皮膚病變也可出現(xiàn)在口唇 、手指、臀部、大腿、手臂，甚至眼部與咽喉。并發(fā)腦膜炎或橫貫性脊髓炎，一般于發(fā)疹后3-12天出現(xiàn)頸項強直等顱內(nèi)壓增高的現(xiàn)象。
三、潛伏感染和復(fù)發(fā)
HSV感染人體后1周左右，血中出現(xiàn)中和抗體，3-4周達(dá)高峰，可持續(xù)多年，這些抗體能清除病毒和使機體康復(fù)，但大多數(shù)個體不能徹底消滅病毒，也不能阻止復(fù)發(fā)，病毒以潛伏狀態(tài)長期存在宿主體內(nèi)。不同亞型HSV感染者急性首發(fā)生殖器皰疹的臨床過程相似，但生殖器病變復(fù)發(fā)率不同，首發(fā)HSV-2感染者約90%，在12個月內(nèi)會出現(xiàn)一次復(fù)發(fā)(平均復(fù)發(fā)4次)，而初次感染HSV-1者僅50%出現(xiàn)類似復(fù)發(fā)(平均復(fù)發(fā)次數(shù)小于1)。不同個體及同一病人一生中生殖器HSV-2感染的復(fù)發(fā)率變化很大，大多數(shù)年復(fù)發(fā)5-9次，一般在原發(fā)皰疹消退后1-4個月內(nèi)發(fā)生，有些患者受到促發(fā)因素，如發(fā)熱、月經(jīng)、日曬、寒冷、某些病毒感染等的影響而復(fù)發(fā)，其特點是每次復(fù)發(fā)往往發(fā)生在同一部位，復(fù)發(fā)前可有前驅(qū)癥狀如局部瘙癢，發(fā)疹前數(shù)小時感染部位有灼燒，麻刺感。
復(fù)發(fā)生殖器皰疹(GH)對患者心理影響較大，由于目前尚無預(yù)防復(fù)發(fā)的有效療法及可能有誘發(fā)生殖器惡變的危險性，故給患者帶來心理影響，患者多有抑郁、恐懼等心理障礙，這又直接影響HSV的復(fù)發(fā)。我們的治療經(jīng)驗，只要患者堅持規(guī)律治療，都能治愈。
四、HSV與HIV感染：
HSV常與HIV-1同時感染，并能促進(jìn)病情發(fā)展，引起嚴(yán)重的局部和播散性感染。目前認(rèn)為HSV是一種調(diào)節(jié)因素，能激活HIV復(fù)制，Heng對6例AIDS合并生殖系統(tǒng)HSV皮膚損害患者進(jìn)行皮膚活檢，發(fā)現(xiàn)角化細(xì)胞和巨噬細(xì)胞均有HIV-1和HSV-1雜交后使HIV-1保留其感染性，而無需與CD4分子結(jié)合即能進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。此外HSV-1能刺激潛伏型HIV-1，而增加HIV-1/HSV-1共同感染和在組織中的復(fù)制。
表皮細(xì)胞發(fā)生氣球樣變性，其中可見有嗜酸性包涵體。表皮開始為網(wǎng)狀變性形成的多房性水皰，以后聚合為單房性水皰。真皮乳頭層有輕度水腫，有輕重不等炎性細(xì)胞浸潤。反應(yīng)嚴(yán)重時可有嚴(yán)重血管炎表現(xiàn)。
HSV感染的診斷要依據(jù)病史、臨床表現(xiàn)和實驗室檢查結(jié)果而定。有不潔性交史，而且在生殖器部位出現(xiàn)皮膚紅斑和原發(fā)性水皰，易復(fù)發(fā)等不難診斷。必要時可作皰液涂片，培養(yǎng)、接種、免疫熒光檢查。血清免疫抗體測定等，均有助于診斷和確定病毒類型。
一、細(xì)胞學(xué)方法
對皮損刮片做Wright-Gemsa (Tzanck試驗)或Papanicolaou染色，可檢出HSV感染特征的巨細(xì)胞包函體，但不能區(qū)別HSV感染或水痘-帶狀皰疹病毒感染，敏感性僅為病毒分離的60%。
二、培養(yǎng)法
從水皰底部取材做組織培養(yǎng)分離病毒，為目前較敏感、最特異的檢查方法，需5-10天，因其技術(shù)條件要求高，價格昂貴，不能普遍使用。
三、抗體檢測
目前最廣泛的是HSV-2抗體檢測，如蛋白印跡法也可用gD2作抗原檢測HSV-2抗體，具有敏感性，且能區(qū)分HSV-1和HSV-2的優(yōu)點。
四、基因診斷
(一)用PCR分型檢測單純皰疹病毒
PCR是一種敏感性高，特異性強的快速檢測方法，標(biāo)本中含有1fg HSV-DNA就可以檢出，其在HSV感染的診斷研究中發(fā)展較快，且分型檢測HSV是發(fā)展的趨勢。
1、標(biāo)本采集和處理
(1)標(biāo)本采集
①腦脊液：直接無菌采取患者0.5ml腦脊液標(biāo)本于無菌試管送檢.如肉眼可見血色，應(yīng)離心取上清。
?、谘蛩皨雰貉? 同上，應(yīng)避免溶血.
?、勰X組織: 腦組織尸檢、活檢標(biāo)本， 加1ml PBS標(biāo)本緩沖液研磨后，待檢。
?、苎奂捌つw病灶分泌物：用預(yù)測(半干)棉拭子直接取患處分泌物， 置1ml PBS標(biāo)本緩沖液中送檢。
?、萆称?宮頸、陰道、外陰、陰莖)標(biāo)本：先用消毒棉拭子擦去病變部位表面粘液、污垢，再用預(yù)潮棉拭子用力擦拭患處分泌物，置1ml PBS標(biāo)本緩沖液中送檢。
(2)標(biāo)本處理
①預(yù)處理：所有液體標(biāo)本均可直接進(jìn)行模板制備;可以取100μl標(biāo)本液，離心5000 r/ minX5min后，去上清，取沉淀物進(jìn)行模板制備。
?、谀０逯苽洌?/p>
a: 蛋白酶K消化裂解法：沉淀物加100μl蛋白酶K消化裂解液，55℃1 h后，煮沸10 min，離心5000 r/ minX5min，收集上清。
b: 水煮法：沉淀物加100μl蒸餾水，搖均水煮20 min，離心5000 r/ minX5min收集上清。
c: 1%Triton X-100裂解法:取采集的標(biāo)本液100μl，加入1μl Triton X-100，水煮20 min，5000 r/ minX5min，收集上清。
d: 5%NP-40裂解法：取采集的標(biāo)本液100μl，加5μl NP-40，水煮20 min ，5000 r/ minX5min收集上清。e: 如標(biāo)本溶血嚴(yán)重經(jīng)上述裂解處理后，再加等體積酚-氯仿抽提、冷乙醇沉淀DNA，加10μl DW溶解待檢。
2、PCR擴增
(1)引物設(shè)計。以HSV DNA聚合酶的高保守區(qū)為檢測靶序列以確保特異性。設(shè)計3個引物，一個上游共同性引物，DNAP5(5′ATGGTGAAAACATCGACATGTACGG3′)：
二個下游特異性引物，DNAP3-1(5′CCTCGCGTTCGTCCTCGTCCTCC3′ )和DNAP3-2(5′CCTCCTTGTCGAGGCCCCGAAAC3′)，可以分別擴增出HSV-1 469bp DNA片段(1981～2359)、HSV-2 391bp片段(1561～1953)：從二型PCR擴增產(chǎn)物中設(shè)計了一個不分型的特異性探針HSVP3 5 ‘GGCGTAGTAGGCGGGGATGTCGCG 3‘)。
(2)PCR實驗體系。取模板10μl： DNAP5 0.5(0.2μmol/L)：DNAP3-1 0.5μl (0.2μmol/L)：DNAP3-2 0.5μl (0.2μmol/L)：4XdNTP 8μl(4X200μmol/L)：10XdNTP 8μl(4X200μmol/L);10X緩沖液10μl：DMSO 4μl;加DW 65.5μl; 石蠟油 30μl.。
水煮(96℃～100℃)7min
加TaqDNA聚合酶1μl;(2.5U)
72℃4 min ↓
95℃40s ↓,
65℃60s → 72℃70s ↓
33個循環(huán)
70℃4 min
3.擴增產(chǎn)物的檢測和分析
(1)瓊脂糖凝膠電泳染色法：取擴增產(chǎn)物20μl加樣品緩沖液4μl混勻后，點樣于2%瓊脂糖凝膠板，70V電泳15～20min，溴化乙錠(EB)染色5min，于紫外燈下觀察結(jié)果在溴酚藍(lán)后面有一條或二條亮紅帶為陽性結(jié)果，HSV-2帶在前，HSV-1帶在后，無帶則為陰性結(jié)果。
(2)XhoI酶譜法：取HSV-1型PCR產(chǎn)物50μl加XhoI50U，37℃1h后，置3%瓊脂糖凝膠中，70V電泳15～20min，可產(chǎn)生46bp片段帶(引物后面);與正常PCR產(chǎn)物比較，XhoI酶切后的大片段電泳位置前移。
(3)Southern印跡法：PCR產(chǎn)物20μl經(jīng)電泳分離后，用變性液處理60min，再用中和液處理90 min，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上：80℃烤膜2 h，42℃預(yù)雜交(雜交液中)30 min， 加入32p標(biāo)記HSVP3探針后，42℃雜交過夜;次日用1%SDS/ PBS pH7.2， 42℃洗15min， 0.5% SDS/PBS pH7.2， 42℃洗15min; 膜置X線暗盒內(nèi)放射性自顯影12～15h， 顯影為陽性， 不顯影為陰性。
(二)套式PCR
套式PCR(nested primers-polymerase chain reaction，NP-PCR)是通過“外側(cè)”、“內(nèi)側(cè)”兩對引物，即一對擴增較大DNA片段的“外側(cè)”引物和一對位于擴增產(chǎn)物中再擴增小片段的“內(nèi)側(cè)”引物，這樣兩次連續(xù)放大可以提高PCR檢測的靈敏度，保證產(chǎn)物的特異性。但該方法不能分型，能100%檢出HSV-1，50%檢出HSV-2，應(yīng)改進(jìn)分型檢測HSV，更好地在臨床應(yīng)用和基礎(chǔ)研究中推廣應(yīng)用。
1、標(biāo)本處理：
(1)標(biāo)本采集同上
(2)DNA 制備：
?、倌X脊液：取100μlCSF 水煮15min，加入250μl無水乙醇，放-30℃10 min;離心10000g30 min，去上清，30℃干燥后，加入10μl DW;
②腦組織細(xì)胞：取沉淀物加100μl蛋白酶K消化裂解液，56℃作用1h，水煮10 min;取上清加入等體積酚一氯仿(V/V)，輕搖10 min，離心10000r/ minX10 min;取水相，加入250μl DW溶解。
2、PCR擴增
(1)引物設(shè)計：選擇HSV1糖蛋白D基因為檢測靶基因。
NP-PCR 的引物和探針序列
“外”引物
BJHSV1.1ATCACGGTAGCCCGGCCGTGTGACA19-43
BJHGV1.2CATACCGGAACGCACCACACAA218-239
“內(nèi)引物”
BJHSV1.3CCATACCGACCACACCGACGA51-79
BJHSV1.4CGTAGTTGGTCGTTCGCGCTGAA166-188
探針
BJHSV-1PROTACGAGGAGGAGCTGTATAACAAAGTCTGT96-125
(2) PCR實驗體系和程序: 反應(yīng)體積為50μl;模板10μl;BJHSV1.1 0.5μl(0.2pmol/L); BJHSV1.2 0.5μl(0.2pmol/L); 10X緩沖液5μl; 4XdNTP 4μl(4X200mmol/L);DW 27μl; 石蠟油30μl。循環(huán)參數(shù)為95℃30s; 55℃30s; 72℃60s; 循環(huán)20次， 取其擴增產(chǎn)物1μl加入含有BJHSV1.3和BJHSV1.4反應(yīng)體系中進(jìn)行套式擴增， 先95℃變性2min，循環(huán)參數(shù)為95℃30s; 55℃30s; 72℃60s; 循環(huán)30次后，72℃延伸5 min;。
(3) 擴增產(chǎn)物分析：
① 瓊脂糖凝膠電泳染色法：
取擴增產(chǎn)物10μl點樣于2%瓊脂糖凝膠中， 70V電泳15-20min，溴化乙錠染色5min，于紫外燈下觀察結(jié)果，在溴酚蘭后面有一條，或二條亮紅條帶為陽性結(jié)果， HSV-2帶在前，HSV-1帶在后，無帶則為陰性結(jié)果。
?、?Southern印跡法：
PCR產(chǎn)物20μl 經(jīng)電泳分離后，用變性液處理60min，再用中和液處理90min，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，80℃烤膜2h，42℃預(yù)雜交(雜交液中)30min，加入32P標(biāo)記HSV探針后，42℃雜交過夜，次日用1%SDS/PBS pH7。2，42℃洗15min，0.5%SDS/PBS pH7.2，42℃洗15min;膜置X線暗盒內(nèi)，放射性自顯影12-15h，，顯影為陽性，不顯影為陰性。
(三)、聚合酶鏈反應(yīng)-酶譜法(polymerase chain reaction-endonuclease cleavage PCR-EC)
具有經(jīng)濟廣泛等特點;不僅能一次性分型檢測HSV-1，HSV-2，EBV，CMV四種病毒，而且方法本身快速、方便、無放射線損傷，易被實驗室接受?？蓹z出3個CFU的HSV1，靈敏度高，能檢測出中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染第1dCSF中HSV DNA陽性結(jié)果，并可用于藥物治療效果的評價。由于病毒的變異性，會出現(xiàn)酶切點突變丟失現(xiàn)象，從而造成酶切陰性結(jié)果。對此可以通過型特異性探針或序列分析解決。
1. 標(biāo)本處理
(1)標(biāo)本采集，方法同上。
(2)DNA模板制備：每份標(biāo)本取200μl，按200μg/ml加入蛋白酶k，56℃作用1h;
加入等體積的酚-氯仿(v/v)輕搖10min，離心1000r/minX5min;取水相加入500μl(2.5倍體積)無水乙醇，-20℃過夜沉淀DNA，離心15000r/minX5min，吸去液體，30℃干燥后，加蒸餾水25μl溶解， 待檢。
2. 引物設(shè)計：
P1，5′CGACTTTGCCAGCCTGTACC3′
P2，5′AGTCCGTGTCCCCGTAGATG3′
(1)PCR實驗體系：
反應(yīng)體積100μl; 模板10μl ; P1 0.5μl(10pmol/L) ，P2 0.5μl(10pmol/L); 4XdNTP 4μl(4X200mmol/L); 10X緩沖液10μl， DMSD 5μl， DW 65μl， 循環(huán)參數(shù)為94℃60s; 60℃60s; 72℃60s;循環(huán)40次72℃延伸4min。
(2)擴增產(chǎn)物檢測與酶切分型.
①第一步電泳鑒定: 取10μlPCR產(chǎn)物加4μl樣品緩沖液，加入2%瓊脂糖凝膠板，70V電泳(5-20min)加EB染色5min后，紫外燈下觀察，可初步鑒定擴增產(chǎn)物大小。
?、诿盖蟹治觯悍謩e取20μlPCR產(chǎn)物于2個Eppendorf管中，加入50μl無水乙醇，-20℃沉淀DNA，再分別用20μlSmal和BamHI反應(yīng)緩沖液溶解，加入SmaI或BamHI 50U于相應(yīng)Eppendorf 管內(nèi)，37℃作用1h。
?、鄣诙诫娪痉中停?0μlPCR酶切物加4μl樣品緩沖液，加到2%瓊脂糖凝膠中，70V電泳，15-20min后， EB染色5min，與同步加入未酶切的PCR產(chǎn)物相對照。 紫外燈下觀察， 結(jié)果如下:
PCR-EC法檢測四種病毒結(jié)果
病毒型號靶片段SmaIBamHI
HSV1518bp476bp+42bp
HSV2518bp-225+293bp
EBV524bp100bp+424bp277bp+247bp
CMV589bp不需酶切，第一步電泳就可以區(qū)分
(四)用RT-PCR檢測單純皰疹病毒
RNA的聚合酶鏈反應(yīng)(RNA-PCR)，可能通過檢測HSV不同期的RNA，這不僅可診斷HSV感染，而且有利于HSV的潛伏期感染機制的深入研究。
RT-PCR是以RNA為模板經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)(RT)產(chǎn)生cDNA，再以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴增以達(dá)到檢測目的。因此，RNA-PCR也可稱為RT-PCR。
1、標(biāo)本處理：
組織塊細(xì)胞總RNA提取，取100mg組織標(biāo)本，加1ml硫氰酸胍變性液，于勻漿器中，室溫研磨均勻后，移入2.5mlEppendorf 管中。依次加入0.1ml3mol/L(pH4.0)NaAc， 1ml水飽和酚和0.2ml氯仿一異戊醇混勻， 用力振搖10s， 置冰浴15min。10000g4℃，離心20min，取上清水相(上層DNA、下層DNA和變性蛋白質(zhì))加入等體積異丙醇置-20℃1h， 沉淀RNA。離心 15000r/minX10min，棄上清， RNA重新用0.3ml硫氰酸胍變性液溶解， 再加0.3ml異丙醇沉淀， -20℃1h， 沉淀RNA. 離心15000r/minX10min， 去上清， 沉淀RNA用75%冷乙醇洗一次， 真空干燥。.加10μl TE緩沖液(pH7.4)溶解，低溫保存?zhèn)溆?臨用前冰浴溶解。 2、PCR擴增:
(1)引物設(shè)計: 選擇HSV-1ICPO基因(極早期)為檢測靶基因.設(shè)計2個引物，
P1 5′GGATCCTCACGTGGTTACCCGCGGTCT 3′
P2 5′AAGCTTCCGGGGCCGTCCCCGCGGGCG 3′可以擴增ICPO 中266bp序列。
1個探針：5′CCGGCTGGAGCCGCCGCACCCTGCT3′。
(2)PCR實驗體系： 總反應(yīng)體積為50μl，模板10μl (0.25-1.0μg)P1 1μl (20pmol/L);P2 1μl (20pmol/L); 4XdNTP 4μl(200μmol/L); 10X緩沖液5μl; AMV(逆轉(zhuǎn)錄酶) 2μl (50U); DW 26μl; 循環(huán)參數(shù)， 94℃變性2min后 94℃50s，60℃60， 72℃60s，循環(huán)40次后72℃延伸5min。
3、擴增產(chǎn)物的鑒定：
(1)瓊脂糖凝膠電泳染色法：取10μl PCR擴增產(chǎn)物加4μl 樣品緩沖液，混勻后加樣2%瓊脂糖凝膠板，70V電泳15-20min，EB染色5min。紫外燈下觀察擴增條帶。
(2)Southern印跡雜交法：用32P標(biāo)記的特異性探針檢測PCR產(chǎn)物，方法同上。
總之，在HSV感染性疾病的臨床診斷中，PCR能對前病毒或潛伏期低復(fù)制的HSV特異性靶DNA片段進(jìn)行擴增檢測，遠(yuǎn)較DNA探針敏感，并能在血清中抗體出現(xiàn)前就可以檢出。因此，PCR無論是作為基礎(chǔ)研究手段，還是作為臨床檢驗診斷方法，均具有廣闊的前景。
五、病理組織學(xué)診斷
細(xì)胞內(nèi)水腫，基底層形成大水皰，病灶周圍有多核巨細(xì)胞浸潤，特別是多核白細(xì)胞與淋巴細(xì)胞充斥于病灶中間。